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黃傘菌提取工藝和免疫活性研究


http://www.dcfneh.tw2015-10-13 13:25:15

 

  黃傘學名Pholiota.adiposa,又名柳蘑,黃蘑,多脂鱗傘,在分類學上屬真菌門Eumycota,擔子菌亞門Basidiomycotina,層菌綱Hymenomycetes,傘菌目Agaricales,球蓋菇科Strophariaceae,環銹傘屬GenusPholipta。秋季生于楊、柳、樺等的倒木或枯枝上,偶然也生于針葉樹干上,單生或叢生。在我國河北、山西、吉林、浙江、河南、西藏、廣西、甘肅、青海、陜西、新疆、四川、云南等地林區均有漫衍[1]。黃傘菌是一種食藥兩用菌,其藥用代價尤其突出。據報道其子實體外貌的一層粘質經鹽水、溫水、堿溶劑提取的多糖有很好的抑菌抗癌浸染,其對小白鼠肉瘤S-180和艾氏腹水癌的克制率達80%~90%[1],還能提防葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎桿菌和結核桿菌傳染[2]。通過單身分和正交試驗優化等要領,研究黃傘菌絲體多糖水提醇沉工藝,并研究了菌絲體多糖的免疫調理活性,以期促進黃傘菌絲體多糖的開拓和操作。

  1原料與要領

  1.1原料

  1.1.1黃傘菌株河北省茂盛縣山區采摘,野陌生散作育;小鼠:Balb/c小鼠(SPF級,8~10周齡,體重28±2g),中國科學院嘗試動物研究中心。

  1.1.2首要試劑RPMI1640作育基,0.25%胰卵白酶,胎牛血清(FBS)購自GIBCO公司;青霉素和鏈霉素購自AMRESCO公司;AlamarBlueAssayKitBiosource公司;植物凝集素(PHA)為Sigma公司產物,其余常用化學試劑,行業標準,均為國產說明純。RPMI1640完全作育基:RPMI1640作育基中加10%加熱滅活的胎牛血清,青霉素30μg/mL,鏈霉素100μg/mL。

  1.1.3作育基

  1.1.3.1母種作育基改善綜合PDA作育基:馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂粉15g、麥芽提取物2g、水1000mL、MgSO40.2g、KH2PO40.25g、K2HPO40.25g、VB10.5mg,pH天然。

  1.1.3.2液體作育基作育基配方:葡萄糖20g、酵母浸粉8g、KH2PO40.4g、K2HPO40.4g、VB120mL(10μg/mL)、pH天然。

  1.1.4儀器二氧化碳作育箱:Thermo公司;SynergyHT酶標儀:BIO-TEK公司;細胞計數儀:BECKMAN-COULTER公司;Centrifuge5415D、5810R離心機:Eppendorf公司;超靜事變臺,恒溫作育箱,干燥箱,恒溫水域鍋,搖床,高壓鍋為嘗試室通例儀器。

  1.2要領

  1.2.1母種作育取收藏菌種,無菌操縱接種于母種作育基上,25℃下作育10d,菌絲體長滿斜面。

  1.2.2搖瓶作育無菌接種后,搖瓶于25℃前提下靜置48h,爾后置于25℃、125r/min作育12d。作育完畢后,發酵液用八層紗布過濾,菌絲體60℃烘干至恒重,備用。

  1.2.3粗多糖提取稱取菌絲體干粉10g,放入回流瓶中,加蒸餾水,熱水提取,4500r/min離心10min取上清去沉淀,沉淀同法一再提取一次,歸并兩次上清液并于80℃水浴濃縮后,邊攪拌邊插手乙醇,醇析后4500r/min離心10min棄上清液,得沉淀物,依次用無水乙醇(1次)、丙酮(2次)洗滌沉淀,60℃干燥得菌絲體粗多糖。

  1.2.4多糖測定苯酚硫酸法[3]。

  1.2.5單身分計劃

  1.2.6淋巴細胞免疫試驗

  1.2.6.1小鼠脾淋巴細胞(體外)的制備[4-5]頸椎脫臼正法小鼠,無菌前提下取脾,置于100目滅菌不銹鋼篩網上,用打針器內塞將脾研碎,過篩,用PBS沖洗網篩2~3遍,脾細胞的懸液轉入無菌的離心管中,再插手PBS至30~40mL,400g離心6min,網絡細胞,在室溫下加NH4Cl溶液(1.5mL/只),不絕槍打或搖擺混勻細胞10min,以裂解紅細胞,加PBS至30~40mL,400g離心5min,去除上清液,插手少量RPMI1640作育基細胞計數儀計數后,用RPMI1640稀釋細胞懸液至2×106個/mL待用。

  1.2.6.2細胞增殖率的測定[4]180μL特定濃度的細胞懸浮液加至96孔板中,別離插手20μL的差異的樣品和陽性比較植物血凝素,陰性比較插手20μLPBS。在37℃和5%CO2的前提下作育3d后,用ELISA自動讀板儀別離測定570nm和600nm的吸光度,插手20μLAlamarBlue顯色劑,作育6~8h,再次測定570nm和600nm的吸光度,然后按照AlamerBlueAssay給的公式計較百般品對淋巴細胞的激活率。淋巴細胞增殖率[117216×Aλ570(sample)-80586×Aλ600(sample)]/[117216×Aλ570(control)-80586×Aλ600(control)]×100%(1)

  2試驗功效

  2.1毀壞粒徑對多糖提取的影響由圖1可知,毀壞粒徑對粗多糖和多糖提取具有必然影響,當粒徑小于120目時顆粒直徑對粗多糖和多糖提取量影響不大,大于120目時粗多糖提取量隨粒徑減小而增進,以顆粒160目時粗多糖提取量和多糖提取量最大,以是最佳毀壞粒徑為160目。

  2.2提取時刻對多糖提取的影響圖2表白提取時刻對粗多糖和多糖提取量影響不大。個中以3和7h粗多糖提取量和多糖含量較高,多糖含量別離為59.3%和63.1%。思量到增進提取時刻就會增進能耗,而多糖提取量增進又很少,以是選擇提取時刻為3h。

  2.3加水體積對多糖提取的影響圖3表現加水量對粗多糖和多糖提取量的影響不大,固然加水量為1:50時粗多糖提取量最高,但多糖含量只有47.86%遠低于1:20加水量時的51.19%和1:40時的54.1%,導致多糖提取量增進很少,即1:50加水時有利于其他物質被提出而對多糖的提取影響不大,因為加水越多后續濃縮就越堅苦,且能源耗損大,本錢進步,以是選擇加水量為1:20。

  2.4提取次數對多糖提取的影響功效見表3,提取次數同粗多糖提取率成正比,同多糖含量成反比。固然提取3次時粗多糖提取率高達10.19%,但因為多糖含量降落,檢測技術,致使最終多糖提取量增進很少,而增進的只是雜質。以是顛末1次提取即可到達有用提取多糖的結果。

  2.5提取溫度對多糖提取的影響圖4表現,溫度與多糖提取相關親近,80℃是較相宜的提取溫度。此時,多糖提取量最高,且多糖含量也較高,表白粗多糖中雜質較少,有利于純化。

  2.6醇析時刻對多糖提取的影響圖5表現醇析12h提取液中多糖已根基所有析出,再增進醇析時刻多糖量增進不明明。

  2.7醇析濃度對多糖提取的影響由圖6可見最相宜乙醇體積分數為100%,即無水乙醇。但粗多糖提取量隨乙醇體積分數升高而增進的幅度要大于多糖提取量,即粗多糖中溶入的雜質量增進,倒霉于純化。

  2.8醇析體積對多糖提取的影響圖7表白插手乙醇體積在3倍以上時,多糖提取量增進不明明,但粗多糖明明增進,可見乙醇體積高出3倍時繼承增進乙醇用量只會增進雜質而對多糖沒有影響。以是乙醇用量1:3時較相宜。

  2.9正交試驗優化提取工藝在上述單身分試驗功效基本上,選取提取時刻(A)、加水體積(B)、提取溫度(C)、乙醇插手體積(D)舉辦正交試驗,進一步優化提取工藝,功效見表4。按照極差說明得出影響身分主次次序:C、D、A、B。即在提取中要出格留意節制好提取溫度,其次醇析時乙醇插手量,再次是提取時刻,最后是加水量。最佳提取工藝是A1B3C2D3,即提取時刻2.5h,加水體積1:25、提取溫度80℃,醇析多糖時行使無水乙醇、3.5倍于多糖溶液、醇析12h。由表5可見,提取溫度對多糖提取的影響較明顯(p<0.10),提取時刻、加水體積和乙醇體積的影響不明顯(p>0.10),即提取溫度對黃傘菌絲體多糖提取的影響起首要浸染。在多糖提取工藝中加水體積和提取時刻直接影響到出產本錢和事變量,團結正交試驗極差和方差說明功效,本試驗選擇最優組合為A1B1C2D3,即提取時刻2.5h、料水比1:15、提取溫度80℃和乙醇體積1:3.5。

  2.10免疫調理試驗功效圖8表現,黃傘菌絲體粗多糖示意出精采的刺激小鼠脾淋巴細胞增殖浸染,在低濃度50μg/mL時小鼠脾淋巴細胞增殖率為141%,跟著多糖濃度的升高,小鼠淋巴細胞增殖率逐漸升高,當濃度為500μg/mL時增值率到達最高的230%,略低于陽性比較PHA(274%),表白黃傘菌絲體粗多糖具有體外調理免疫的浸染,且示意為劑量依靠。

  3結論

  通過單身分試驗和正交試驗確定了黃傘菌絲體多糖提取最佳工藝,即菌絲體毀壞粒徑為80目、加水量1:15、提取時刻2.5h、提取溫度80℃、提取1次,醇析多糖時行使無水乙醇、3.5倍于多糖溶液、醇析12h。免疫活性研究表現黃傘菌絲體粗多糖,可以刺激小鼠脾淋巴細胞增殖,表白黃傘菌絲體粗多糖具有調理免疫的浸染,且示意為劑量依靠。連年來有關多糖的研究報道增進迅猛,正逐漸成為成果性食物和新藥篩選的新來歷。多糖作為藥物始于1943年,作為廣譜的免疫促進劑而引起人們的極大樂趣是在20世紀60年月往后[7],大量研究表白,多糖具有明明的加強機體免疫手段[8-11]和克制腫瘤[12]的浸染。黃傘菌作為食藥兩用菌,具有抗腫瘤浸染[13-14],同時對免疫體系也具有調理浸染,蘇延友等[15](2004)報道黃傘子實體多糖可以激活小鼠腹腔巨噬細胞;李德海等[16]研究發明(2010)黃傘子實體多糖能明顯進步小鼠的免疫器官質量;本研究表現黃傘菌絲體多糖同子實體多糖一樣對免疫體系具有調理浸染。大型真菌的菌絲體出產不受季候、情形身分影響,可以實現整年出產,大大改進了子實體出產的破綻,同時大型真菌子實體今朝市場代價較高,如再進一步深加工勢必導致深加工產物價值奮發,難于推廣,而菌絲體出產本錢低,作為深加工質料上風明明,檢測技術,信托黃傘菌絲體多糖具有精采的開拓和應用遠景。

 

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